技術(shù)文章
Technical articles傷口感染是指?jìng)谠谟线^程中仍被細(xì)菌或其他微生物感染的疾病。與急性傷口不同,慢性感染性傷口通常經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間的愈合過程或無法愈合,給患者帶來了嚴(yán)重的后果和沉重的負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)上,感染傷口的治療方法主要包括定期傷口清創(chuàng)、口服抗生素、抗菌敷料等。但是這些方法都有一定的局限,首先,細(xì)菌在傷口部位產(chǎn)生的生物膜形成物理屏障,限制抗菌劑或生物大分子滲透到深部組織,從而顯著降低藥物遞送效率;其次,抗生素的誤用和過度使用是增加抗生素耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的主要驅(qū)動(dòng)因素,抗生素耐藥性已成為嚴(yán)重的全球健康問題;此外,頻繁更換敷料,可能會(huì)導(dǎo)致傷口疼痛和繼發(fā)性損傷,從而顯著降低患者的依從性。因此,非常需要研發(fā)一種新的傷口愈合治療策略。
基于此,武漢大學(xué)藥學(xué)院黎威教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)開發(fā)了一種具有長(zhǎng)效抗菌效果的活性益生菌微針貼片,用于治療慢性感染傷口。該微針貼片是利用摩方精密 microArch® S240 (精度:10μm)3D打印設(shè)備加工模具后經(jīng)PDMS翻模制備而成,相關(guān)研究成果以“Accelerated infected wound healing by probiotic-based living microneedles with long-acting antibacterial effect"為題發(fā)表在期刊《Bioactive Materials》上。武漢大學(xué)藥學(xué)院碩士研究生靳銀麗、武漢大學(xué)中南醫(yī)院藥劑科盧云、武漢大學(xué)藥學(xué)院博士研究生江雪為共同第一作者,武漢大學(xué)藥學(xué)院黎威教授、武漢大學(xué)中南醫(yī)院整形美容科郭亮主任醫(yī)師為共同通訊作者。
該微針貼片(5% GL MN)由聚乙烯醇(PVA)、蔗糖、5%甘油和羅伊氏乳桿菌制成。其中,PVA-蔗糖基質(zhì)為5% GL MN提供足夠的機(jī)械強(qiáng)度,促進(jìn)5% GL MN在插入皮膚后快速溶解,從而實(shí)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌的快速遞送;羅伊氏乳桿菌可以代謝甘油產(chǎn)生具有抗菌作用的羅氏菌素,從而在慢性感染傷口處實(shí)現(xiàn)抗菌、減少炎癥、促進(jìn)傷口愈合的作用。值得注意的是,在5% GL MN中加入的甘油不僅不影響羅伊氏乳桿菌的存活,而且還為羅伊氏乳桿菌持續(xù)產(chǎn)生羅氏菌素提供了充分來源,從而在傷口深處實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效抗菌和抗炎作用。
圖1.用于慢性感染傷口愈合的5% GL MN示意圖。(a)含有羅伊氏乳桿菌的5% GL MN示意圖。(b)羅伊氏乳桿菌具有抗菌和抗炎作用的工作機(jī)理。(c)5% GL MN具有長(zhǎng)效抗菌作用,可加速感染傷口愈合。
首先采用真空輔助微成型方法制備GL MNs 貼片,并對(duì)微針的形貌、機(jī)械強(qiáng)度、穿刺皮膚的能力、溶解速度以及釋藥效率等進(jìn)行一系列表征。
圖2. GL MNs貼片的制造和表征。(a)GL MNs貼片的制作過程示意圖。(b)具有不同甘油濃度的GL MNs 貼片的代表性明場(chǎng)顯微鏡圖像。(c)分別含有0%、2.5 %和5 %甘油的GL MNs 貼片的力-位移曲線。(d)GL MNs 貼片插入豬皮膚后的代表性明場(chǎng)和熒光顯微鏡圖像。(e)施用GL MNs貼片后豬皮膚的組織學(xué)切片圖像。(f)GL MNs貼片施用于豬皮膚后不同時(shí)間的代表性明場(chǎng)顯微鏡圖像。(g)施用于豬皮后殘留微針長(zhǎng)度的定量分析。(h)GL MNs 貼片在PBS中的累積藥物釋放。每個(gè)點(diǎn)代表平均值±SD(n = 3),***P < 0.001。
制備的GL MNs 貼片結(jié)構(gòu)為基底半徑200 μm,高度850 μm,尖部半徑~10 μm的錐形,微針排列成10×10陣列,面積為7 mm×7 mm。羅伊氏乳桿菌以良好的形態(tài)封裝在微針內(nèi)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)結(jié)果顯示,羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生的物質(zhì)中存在與3-羥基丙醛(3-HPA)相對(duì)應(yīng)的分子離子峰(M=74.0607),這表明羅伊氏乳桿菌具有產(chǎn)生抗菌物質(zhì)羅氏菌素的能力。定量分析表明,5 % GL MNs 中的羅伊氏乳桿菌能產(chǎn)生更多的羅氏菌素。而羅氏菌素可以引起大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌的顯著形態(tài)變化,據(jù)推測(cè),羅氏菌素通過抑制細(xì)菌核糖核苷酸還原酶的活性,而核糖核苷酸還原酶對(duì)DNA合成至關(guān)重要,從而實(shí)現(xiàn)廣譜抗菌活性。
圖3. 5% GL MN 貼片的表征和羅氏菌素的抗菌作用。(a)5% GL MN 貼片(b)5% GL MN貼片單根針的橫截面和(c)從5% GL MN 貼片中提取的羅伊氏乳桿菌的FESEM圖像,(b)中的黃色箭頭表示微針中存在羅伊氏乳桿菌。(d)對(duì)5% GL MN 貼片中羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生的羅氏菌素的LC-MS分析。(e)含有不同濃度甘油的GL MNs貼片產(chǎn)生羅氏菌素的定量分析。(f)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌用羅氏菌素治療后形態(tài)的代表性FESEM圖像。每個(gè)點(diǎn)表示平均值± SD(n = 3),*P < 0.05,***P < 0.001。
隨后,為了進(jìn)一步評(píng)估5% GL MN貼片的抗菌效果,通過細(xì)菌的活死染色實(shí)驗(yàn)、平板涂布和抑菌圈實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證5% GL MN貼片具有良好的抗菌效果。此外,5 % GL MN貼片在體外也顯示出有效的金黃色葡萄球菌生物膜清除率,這通常在有害細(xì)菌的耐藥性中起關(guān)鍵作用。
圖4. 5% GL MN貼片在體外的抗菌作用。(a)金黃色葡萄球菌與GL MNs貼片孵育24小時(shí)后的活/死測(cè)定。(b)GL MNs貼片處理后大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌的細(xì)菌死亡率。(c) LB瓊脂平板的代表性明場(chǎng)圖像,顯示大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌在與不同GL MNs貼片孵育24小時(shí)后的生長(zhǎng)情況。(d)接受不同GL MNs貼片處理24小時(shí)后LB液體培養(yǎng)基中大腸桿菌,金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞桿菌的OD600值。(e)不同GL MNs貼片處理24小時(shí)對(duì)大腸桿菌,金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞桿菌抑制區(qū)的代表性明場(chǎng)圖像。紅色虛線圓圈表示對(duì)藥敏片的位置,黑色虛線圓圈表示抑制區(qū)。(f)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞桿菌的抑制區(qū)的直徑。每個(gè)點(diǎn)代表平均值±SD(n = 3),***P < 0.001。ns 表示無顯著性差異。
圖5. 5% GL MN貼片體外的生物膜清除效果。(a)金黃色葡萄球菌接受不同治療后的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像。綠色:活細(xì)菌。(b)不同微針處理后用結(jié)晶紫染色的生物膜圖像。(c)金黃色葡萄球菌在(a)中接受不同處理后的生物膜清除率。(d)金黃色葡萄球菌在(b)中用不同微針處理后的生物膜清除率。每個(gè)點(diǎn)表示的平均值±SD(n = 3)。*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001。ns 表示無顯著性差異。
緊接著,通過流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)、蛋白質(zhì)印跡(WB)驗(yàn)證了基于羅伊氏乳桿菌GL MNs貼片的抗炎作用。
圖6. 體外GL MNs貼片的抗炎特性。(a)流式細(xì)胞術(shù)分析不同組的RAW 264.7的細(xì)胞內(nèi)CD86的熒光強(qiáng)度。(b)不同組的流式細(xì)胞術(shù)直方圖。(c)不同組的CD86相對(duì)表達(dá)水平。(d-e)不同處理后通過qPCR測(cè)定RAW 264.7細(xì)胞中IL-6和TNF-α的表達(dá)水平。(f-h)不同處理后通過蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定RAW 264.7細(xì)胞中IL-6和TNF-α的表達(dá)水平。每個(gè)點(diǎn)表示平均值±SD(n = 3),*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001。
基于GL MNs貼片的形態(tài)、皮膚穿透能力、機(jī)械強(qiáng)度、溶解速度和抗菌功效等方面的表征,確定5 % GL MN是遞送羅伊氏乳桿菌到傷口處進(jìn)行抗菌的最佳方案。之后,細(xì)胞活死染色實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)證明了5% GL MN貼片在體外具有優(yōu)異的生物相容性。羅伊氏乳桿菌在5% GL MN貼片中的穩(wěn)定性對(duì)于維持其抗菌活性至關(guān)重要,將5% GL MN貼片在4℃和25℃下分別保存,羅伊氏乳桿菌在室溫下可在5% GL MN貼片中存活7天,超過40%的活菌保留在貼片中;將貼片置于4℃時(shí),羅伊氏乳桿菌在60天后仍保持高活力(>80%),這表明羅伊氏乳桿菌在5% GL MN貼片中具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
圖7. 5% GL MN貼片的細(xì)胞毒性和穩(wěn)定性。(a)接受不同處理后NIH-3T3細(xì)胞的活/死測(cè)定。(b) 接受不同處理后 NIH-3T3 細(xì)胞和 HUVEC 細(xì)胞的活力分析。MRS瓊脂平板的明場(chǎng)圖像顯示0%和5% GL MN貼片中羅伊氏乳桿菌在25℃(c)或4℃(e)下儲(chǔ)存時(shí)細(xì)菌活力隨時(shí)間變化情況。在25℃(d)或4℃(f)下儲(chǔ)存不同時(shí)間后,0%和5% GL MN貼片中羅伊氏乳桿菌的菌落計(jì)數(shù)。每個(gè)點(diǎn)表示平均值±SD(n = 3)。
然后,在小鼠身上建立全層皮膚傷口模型,將5% GL MN貼片施用于傷口處,可以看到5% GL MN貼片可以促進(jìn)傷口的愈合,并且對(duì)傷口處的金黃色葡萄球菌有持續(xù)的抑制作用。
圖8. 5% GL MN貼片在體內(nèi)的抗菌作用。(a)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間方案。(b)小鼠接受不同治療后第0、3、5、7、9天皮膚傷口的代表性圖片。黑色虛線圓圈表示原始傷口區(qū)域(直徑:1厘米)。(c)9天內(nèi)不同組的傷口形態(tài)變化示意圖。(d)不同組在第 0、3、5、7和9天從傷口組織中分離出的金黃色葡萄球菌菌落的代表性圖像。(e)不同處理的小鼠皮膚傷口剩余面積比例-時(shí)間曲線。(f)不同組在第 0、3、5、7 和9天從傷口組織中分離的金黃色葡萄球菌菌落計(jì)數(shù)。(g)小鼠接受不同治療后的體重變化。每個(gè)點(diǎn)表示平均值±SD(n = 7),*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001。ns表示無顯著性差異。
最后,對(duì)小鼠傷口處皮膚進(jìn)行病理學(xué)切片染色,H&E、Masson、IL-6、CD31染色表明,5% GL MN貼片具有良好的促進(jìn)傷口愈合、減少炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成的作用。
圖9. 不同治療后的組織再生、炎癥反應(yīng)和血管生成。第9天不同處理后(a)H&E染色(b)Masson染色和(c)IL-6免疫組化染色的代表性明場(chǎng)顯微圖像。(a)中的藍(lán)色箭頭表示傷口長(zhǎng)度,黑色箭頭表示傷口厚度。(d)在第9天不同治療后用CD31(紅色)和DAPI(藍(lán)色)染色后傷口組織新生血管形成的免疫熒光圖像。第9天不同治療組的H&E染色顯示的傷口長(zhǎng)度(e)和傷口厚度(f)分析。(g)第9天不同治療組的膠原蛋白體積分?jǐn)?shù)(CVF)。(h)在第9天不同治療組IL-6的陽性細(xì)胞數(shù)。(i)第9天不同治療的CD31陽性細(xì)胞數(shù)。每個(gè)點(diǎn)表示平均值±SD(n = 7),*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001。
結(jié)論:綜上,研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新型且生物相容性良好的益生菌微針貼片,具有長(zhǎng)效抗菌作用,可促進(jìn)感染傷口的愈合。微針貼片為益生菌提供了良好的保護(hù),在4℃下,它在微針貼片內(nèi)保持高達(dá)80%的活力超過60天。插入皮膚后,微針貼片迅速溶解并實(shí)現(xiàn)益生菌在深層傷口組織中的快速遞送,益生菌能夠在傷口中存活約一周,并不斷將共同遞送的甘油轉(zhuǎn)化為抗菌物質(zhì),從而在感染的傷口中實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效抗菌作用。在金黃色葡萄球菌感染傷口的小鼠模型中,與對(duì)照組相比,一次施用益生菌微針貼劑在消除有害細(xì)菌和促進(jìn)傷口閉合方面表現(xiàn)出更好的效果,同時(shí)減少炎癥、增強(qiáng)組織再生和血管生成,這對(duì)慢性感染傷口的治療具有巨大潛力。