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新型光散射抑制機(jī)制助力高保真光固化生物3D打印

更新時(shí)間:2023-06-01點(diǎn)擊次數(shù):723
光固化生物3D打印技術(shù)(如:數(shù)字光處理,DLP)可精確控制細(xì)胞和生物材料在空間中的分布,以此構(gòu)建復(fù)雜幾何結(jié)構(gòu),被廣泛應(yīng)用于組織工程、藥物篩選、外科植入物等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。然而,在DLP打印過(guò)程中,光在固液兩相界面會(huì)產(chǎn)生物理散射,細(xì)胞的混入會(huì)加劇此種散射效應(yīng),導(dǎo)致水凝膠在非目標(biāo)區(qū)域固化,降低了打印精度,使眾多生物性能優(yōu)異且具有小尺度特征(如血管網(wǎng)絡(luò)和薄壁結(jié)構(gòu)等)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)難以成型,限制了DLP打印技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。針對(duì)這一挑戰(zhàn),湖南大學(xué)機(jī)械與運(yùn)載工程學(xué)院韓曉筱教授等提出了一種光吸收與自由基反應(yīng)協(xié)同作用的光散射抑制新機(jī)制,并基于此機(jī)制開(kāi)發(fā)了一種新型光抑制劑(Curcumin-Na,Cur-Na),降低了載細(xì)胞水凝膠光固化打印過(guò)程中的光散射效應(yīng),將打印精度提高到1.2-2.1像素點(diǎn),幾何誤差低于5%,成功制造了各種具有多尺度通道和薄壁網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的生物活性功能支架。此外,該方法具有較寬的打印參數(shù)窗口,極大地縮短了參數(shù)優(yōu)化過(guò)程。相關(guān)研究成果以題為"Photoinhibition via simultaneously photoabsorption and free-radical reaction for high-fidelity light-based bioprinting"的文章發(fā)表在《Nature Communications》(SCI一區(qū),Top期刊,IF=17.69)。湖南大學(xué)博士研究生賀寧為第一作者,湖南大學(xué)機(jī)械與運(yùn)載工程學(xué)院韓曉筱教授和陳鋒副教授為通訊作者。



水凝膠生物墨水中傳統(tǒng)的光吸收劑能夠吸收過(guò)量的光能量,防止打印層厚過(guò)厚,從而在一定程度上提高垂直方向上的打印精度。然而,傳統(tǒng)的光吸收劑難以解決由光散射引起的水平方向上過(guò)固化的問(wèn)題。因此,該研究提出了光吸收與自由基反應(yīng)協(xié)同作用的光抑制機(jī)制:保留傳統(tǒng)光吸收劑功能的同時(shí)并能“搶奪"水平方向上散射光激發(fā)的自由基,抑制散射區(qū)域的自由基與水凝膠發(fā)生聚合反應(yīng),防止非目標(biāo)區(qū)域的固化,從而提高水平方向上的打印精度和保真度?;诖藱C(jī)制,該團(tuán)隊(duì)首先成功開(kāi)發(fā)了一種新型光抑制劑(Cur-Na)(如圖1),其具有良好水溶性和生物相容性。接著,該團(tuán)隊(duì)制備了含不同光抑制劑的PEG-GelMA生物墨水,通過(guò)研究生物墨水的物化性質(zhì)評(píng)價(jià)了其可打印性和機(jī)械性能(如圖2)。然后通過(guò)理論和實(shí)驗(yàn)研究聚合過(guò)程,揭示了Cur-Na減輕散射效應(yīng)的機(jī)制(如圖3):Cur-Na的吸收峰位于425nm附近,非常接近光源波長(zhǎng),可以作為典型的光吸收劑降低光穿透深度。同時(shí),Cur-Na 可以通過(guò)更高的反應(yīng)速率競(jìng)爭(zhēng)性地?fù)寠Z自由基來(lái)阻止水凝膠單體聚合形成固化水凝膠。再者,Cur-Na 的反應(yīng)產(chǎn)物液體,避免非目標(biāo)區(qū)域的固化。由于 Cur-Na 的高反應(yīng)性速率,固定濃度的 Cur-Na 可以在很寬的光強(qiáng)度范圍內(nèi)抑制散射效應(yīng),避免在打印不同結(jié)構(gòu)的時(shí),打印參數(shù)再次優(yōu)化,提高打印效率文章中,圖4和圖5定量研究了加入Cur-Na后的生物墨水的打印分辨率和圖案保真度,以驗(yàn)證Cur-Na在解決光散射效應(yīng)方面的有效性。之后,團(tuán)隊(duì)將添加了Cur-Na的生物墨水應(yīng)用到摩方精密 microArch S140光固化打印機(jī)中,成功地制造了各種復(fù)雜結(jié)構(gòu)體(仿生支架,可灌注血管網(wǎng)絡(luò),極小三周期曲面等),證明了該光抑制劑在制造具有小尺度特征的功能性載細(xì)胞三維支架方面的卓。越能力(如圖6)。圖7進(jìn)一步證明了此生物墨水在組織工程中的適用性。


圖片圖1姜黃鈉的合成。a. 用姜黃素和碳酸氫鈉合成姜黃素鈉(Cur-Na)的過(guò)程。姜黃素分子中酚羥基的H+被Na+取代(紅色橢圓),而姜黃素中的羰基鍵發(fā)生酮-烯醇互變異構(gòu)(藍(lán)色橢圓)。b. 姜黃素和Cur-Na的1H-NMR光譜,顯示了合成過(guò)程中發(fā)生的化學(xué)性質(zhì)的代表性變化。藍(lán)色陰影區(qū)域表示酚羥基的特征共振(δ=9.65ppm)。綠色陰影是烯烴信號(hào)(δ=5.93ppm),表明C=C雙鍵的形成。

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圖2生物墨水的物化性質(zhì)。添加了不同濃度光抑制劑的生物墨水(PEG-GelMA/LAP)的儲(chǔ)能模量(G'反映材料的剛度)和損失模量(G''反映材料粘度)隨時(shí)間的變化:a.檸檬黃和b. Cur-Na。G'和G'之間的交叉點(diǎn)被稱(chēng)為凝膠點(diǎn),而凝膠時(shí)間被定義為曝光開(kāi)始至凝膠點(diǎn)的時(shí)間(在該研究中約為20秒)。生物墨水在405nm、13mW cm?2的光照下曝光30s。陰影區(qū)域表示曝光時(shí)間。c. 水凝膠的應(yīng)力-應(yīng)變曲線(xiàn)。d. 三種水凝膠在~20%應(yīng)變下的彈性模量。三種生物墨水的e. 溶脹比和f. 溶膠分?jǐn)?shù)對(duì)比。

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圖3. Cur-Na抑制散射效應(yīng)的機(jī)制。a. 示意圖顯示了當(dāng)光穿透生物墨水時(shí)光強(qiáng)的高斯分布以及不同情況下產(chǎn)生的固化區(qū)域,包括無(wú)散射、有散射、與細(xì)胞混合的生物墨水和添加Cur-Na的生物墨水。Cd和Cw分別是固化深度和固化寬度。E0表示生物墨水表面的光強(qiáng)度,而EC是引發(fā)聚合所需的臨界能量。b. Cur-Na自由基鏈生長(zhǎng)聚合的動(dòng)力學(xué)過(guò)程由三個(gè)階段控制:(1)引發(fā)、(2)鏈傳播、(3)(4)終止。ki,kp,ktc和ktd分別是四種反應(yīng)中的速率常數(shù)。每個(gè)Cur-Na與三個(gè)自由基(R·)反應(yīng),引發(fā)聚合物鏈生長(zhǎng),形成單體(M)。激活后的單體可以與其他單體反應(yīng),聚合物鏈通過(guò)傳播而增長(zhǎng),形成Mn·和Mm·。當(dāng)鏈傳播通過(guò)終止反應(yīng)終止時(shí),形成聚合物(Mn和Mm)。c. Cur-Na和PEGDA聚合過(guò)程中官能團(tuán)的轉(zhuǎn)化率與時(shí)間的關(guān)系。散射區(qū)域的自由基可以被Cur-Na快速消耗;水凝膠單體由于缺乏自由基而難以在散射區(qū)域形成聚合物。

 

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圖4水平方向打印精度分析。a. 輻條狀圖案用于評(píng)估打印精度,從中心到外圍相鄰輻條之間的間隙增加。打印精度被定義為模糊區(qū)域直徑(紅色虛線(xiàn)圓圈)與輻條狀圖案直徑的比值。b. 載細(xì)胞結(jié)構(gòu)的熒光染色圖。c. 打印結(jié)構(gòu)的顯微圖像,顯示了純PEG-GelMA生物墨水(上)和添加了檸檬黃(中)和Cur-Na的生物墨水(下)的模糊區(qū)域(紅色虛線(xiàn)圓圈)大小與相對(duì)曝光能量的關(guān)系。Er指相對(duì)能量,定義為實(shí)際光能與單位曝光量的比。d. 模糊區(qū)域大小與曝光能量的定量關(guān)系。e. Cur-Na的高精度打印窗口,灰色、紅色、藍(lán)色區(qū)域分別代表含1mM、2mM、3mM Cur-Na生物墨水的打印窗口寬度。f. 載細(xì)胞打印結(jié)構(gòu)的模糊區(qū)域大小與曝光能量之間的定量關(guān)系。


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圖5多層打印中的中空通道打印性分析與評(píng)定高保真度的打印誤差分析。a. 具有不同直徑(D=300、500和700μm)通道的圓柱體的3D CAD設(shè)計(jì)。H表示圓柱體的高度,而h1、h2和h3是通道的中空部分。打印精度定義為中空部分與通道總長(zhǎng)度之間的比率。b. 連續(xù)層打印中的散射效應(yīng)及其引起的過(guò)固化現(xiàn)象。c-e. 打印精度隨圓柱體直徑的高度和通道直徑的關(guān)系。f. 具有不同直徑的多通道結(jié)構(gòu)CAD設(shè)計(jì)。g. 分別使用含Cur-Na和檸檬黃的生物墨水打印的樣品。h. 通道的實(shí)際直徑與設(shè)計(jì)直徑間的差異。

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圖6. Cur-Na在打印生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中常用的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)時(shí)的分辨率和高保真度a. 脊髓支架。它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)呈現(xiàn)不規(guī)則的通道和薄壁網(wǎng)絡(luò),模仿脊髓的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。使用兩種類(lèi)型的水凝膠成功地制備了支架:PEG-GelMA(10%)和甲基丙烯酸縮水甘油酯改性的絲素蛋白(Sil-MA(15%))。b. 具有多個(gè)分支、可灌注通道(200-800μm)和薄壁(~100μm)的血管網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)注射有色染料溶液進(jìn)行灌注。c. 具有獨(dú)。特拓?fù)涮卣鳎ㄇ?、高孔隙率和連通性)的gyroid支架。d. 打印載HepG2細(xì)胞的gyroid支架并培養(yǎng)14天,展現(xiàn)了良好的細(xì)胞增殖效果。


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圖7基于PC-12細(xì)胞體外培養(yǎng)的Cur-Na 細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)。a. 細(xì)胞活死染色熒光圖展示了細(xì)胞14天的活力(綠色:活細(xì)胞;紅色:死細(xì)胞)。b. CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞在支架中增殖14天,PEG-GelMA/Cur-Na水凝膠中的細(xì)胞展現(xiàn)出最。。好的增殖效果。c. 使用PEG-GelMA/Cur-Na水凝膠制造的通道支架(直徑200μm)的熒光圖像顯示了均勻的細(xì)胞分布。最后一張圖像顯示了細(xì)胞沿著通道的生長(zhǎng)情況。d. 第1、7和14天脊髓支架中通道的共聚焦圖像。e. 熒光圖像顯示種植在PEG-GelMA/Cur-Na支架表面的PC-12細(xì)胞的分化和突起形成(第7天)。Tuj-1:Beta3-微管蛋白;DAPI:4’,6-二胺基-2苯基吲哚。


結(jié)論



該研究提出了一種光吸收和自由基反應(yīng)協(xié)同作用的光抑制新機(jī)制,有效抑制光輔助3D打印中的光散射效應(yīng)?;诖藱C(jī)制,開(kāi)發(fā)了一種新的光抑制劑(Cur-Na),具有以下獨(dú)。特優(yōu)勢(shì):(1)顯著提高打印分辨率和保真度:在限制水凝膠的溶脹下,打印精度可接近打印機(jī)理論極限(~1像素);(2)具有良好打印參數(shù)適應(yīng)性,極大簡(jiǎn)化了打印參數(shù)優(yōu)化過(guò)程;(3)在制造具有微尺度通道和薄壁等復(fù)雜支架結(jié)構(gòu)上展現(xiàn)出卓。越能力,對(duì)于支架內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和氧氣的滲透具有重要意義;(4)能成功制造對(duì)光散射效應(yīng)尤其敏感的載細(xì)胞Gyroid支架,且在歷經(jīng)14天的培養(yǎng)后,支架內(nèi)細(xì)胞展現(xiàn)出良好的增殖態(tài)勢(shì)。(5)此方法可應(yīng)用于其他由自由基鏈生長(zhǎng)聚合控制的可光固化墨水中(例如Sil-MA等)。該研究提供的將多尺度特征直接賦予組織結(jié)構(gòu)的方法,對(duì)于更好地模擬天然組織微環(huán)境至關(guān)重要。研究中確立的策略提高了生物3D打印高保真復(fù)雜結(jié)構(gòu)的可打印性和可操作性,從而助力更*的組織工程和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用的實(shí)現(xiàn)。